Esta historia trata de un intento de asesinato contra Mathilde Stangerson, hija del científico Stangerson. Mathilde Stangerson vive en el castillo del Glandier en primavera. El castillo del Glandier es un castillo de dos pisos, cuyo dueño es el científico Stangerson. Mathilde duerme siempre en un cuarto específico, pintado de amarillo, al cual llama "El cuarto amarillo".
Cuando ella se va a dormir una noche, pone seguro a la puerta, y se encierra por completo, lo cual le parece sospechoso a su padre y al mayordomo, llamado Tío Jacques. Poco después, se oyen gritos y disparos en su cuarto, lo cual hace que su padre se alarme, junto con su mayordomo. Los dos intentan abrir la puerta del dormitorio, pero no pueden. Mathilde sigue gritando, y su voz se oye decir "Auxilio, padre, me matan. ¡Auxilio, padre, un asesino!". Cuando logran abrir la puerta, aparece Mathilde, sangrando y con un golpe en la sien, tirada en el suelo, pero no se encuentra al culpable en el cuarto. Sin embargo, se verifica que las ventanas están cerradas por dentro, y no hay ningún lugar por el cual el culpable pudiera haber escapado. El cuarto está lleno de sangre, y tiene marcas de una dura pelea.

Una pistola dentro del cuarto es lo único que queda del asesino, además de un disparo hecho con la pistola. Al examinar más detalladamente la pistola, la policía descubre que es propiedad del Tío Jacques. Cuando Mathilde se recupera, declara que ella fue quien tomó la pistola y la llevó a su cuarto, pero se niega a decir por qué. Entonces, Joseph Rouletabille es llamado por el señor Stangerson para resolver el caso, pero la policía contrata, por su parte, a Federico Larsan, uno de los mejores detectives de Inglaterra.